Resumos

FITOPATOLOGIA

Promoção do crescimento do feijoeiro e controle da antracnose por Trichoderma spp

Plant growth promotion of common bean and anthracnose control by Trichoderma spp

Erica Aparecida de Souza Pedro^* * In memoriam ; Ricardo Harakava; Cleusa Maria Mantovanello Lucon; Sylvia Dias Guzzo

Instituto Biológico, Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Vegetal, Laboratório de Bioquímica Fitopatológica, Caixa Postal 12.898, CEP 04010-970 São Paulo, SP. E-mail: harakava@biologico.sp.gov.br, mantova@biologico.sp.gov.br, guzzo@biologico.sp.gov.br

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade de Trichoderma spp. em promover o crescimento de plantas de feijão e reduzir a severidade da antracnose do feijoeiro (Colletotrichum lindemuthianum), bem como identificar os isolados mais eficientes. Sessenta isolados de Trichoderma spp. foram avaliados quanto à capacidade de promoção do crescimento nas plantas. Os sete isolados que mais se destacaram foram adicionados ao substrato de cultivo e avaliados quanto à redução na severidade da antracnose em plantas de feijão tratadas com conídios de C. lindemuthianum. Os mais eficientes no controle da doença foram identificados por sequenciamento de DNA. O isolado IB 28/07 foi avaliado nas concentrações 0,5, 1, 1,5 e 2% (peso:volume), que reduziram a severidade da doença em 41,51, 55,15, 81,82 e 96,06%, respectivamente. Os isolados mais eficientes de Trichoderma spp. podem proporcionar aumentos superiores a 30% na produção de matéria seca da parte aérea das plantas e reduzir a severidade da doença entre 63 e 98%. Esses isolados foram identificados como pertencentes às espécies Trichoderma harzianum, T. strigosum e T. theobromicola.

Termos para indexação:Colletotrichum lindemuthinum, bioprospecção, controle biológico, resistência sistêmica, sequenciamento de DNA.

ABSTRACT

The objective of this work was to evaluate the ability of Trichoderma spp. to promote growth of common bean plants and to reduce severity of anthracnose (Colletotrichum lindemuthianum), as well as to identify the best performing isolates. Sixty Trichoderma spp. isolates were evaluated as to their capacity to promote growth in common bean. The seven isolates that stood out were added to the culture substrate and assessed for reduction in severity of anthracnose in bean plants treated with C. lindemuthianum conidia. The most efficient isolates in controlling the disease were identified by DNA sequencing. The IB 28/07 isolate was evaluated in the concentrations 0.5, 1, 1.5, and 2% (weight:volume), which reduced disease severity in 41.51, 55.15, 81.82, and 96.06%, respectively. The most efficient Trichoderma spp. isolates can promote increases above 30% in dry matter production and reduce disease severity between 63 and 98%. These isolates were identified as belonging to the species Trichoderma harzianum, T. strigosum, and T. theobromicola.

Index terms:Colletotrichum lindemuthianum, bioprospection, biological control, systemic resistance, DNA sequencing.

Introdução

A antracnose do feijoeiro, causada pelo fungo Colletotrichum lindemuthianum (Sacc & Magn), é uma das doenças mais importantes da cultura, pois reduz a produção e a qualidade dos grãos (Chiorato et al., 2006). As perdas causadas pela doença podem chegar a 100%, principalmente quando são utilizadas sementes infectadas e as condições de temperatura e umidade relativa do ar são favoráveis (Vechiato et al., 2001).

A aplicação indiscriminada de defensivos agrícolas pode ter efeito deletério sobre o meio ambiente e a saúde humana, bem como levar ao surgimento de fitopatógenos resistentes aos produtos rotineiramente empregados (Naseby et al., 2000). Portanto, há grande relevância no estudo de métodos alternativos de controle de pragas e doenças. Neste sentido, o controle biológico pode contribuir para reduzir o impacto da agricultura no ambiente (Gaur & Sharmam, 2010).

Espécies do gênero Trichoderma vêm sendo utilizadas com sucesso no controle de fitopatógenos, por serem capazes de proteger plantas por meio de mecanismos como parasitismo, antibiose, competição por nutrientes e substrato, e indução de resistência. Além disso, essas espécies colonizam com facilidade o sistema radicular e promovem o crescimento de diversas espécies de plantas (Woo et al., 2006; Vinale et al., 2008). Estudos de emprego de Trichoderma spp. no controle de doenças de plantas têm focalizado os efeitos diretos deste antagonista sobre fitopatógenos. No entanto, a indução de resistência de plantas também tem sido considerada um mecanismo relevante (Yoshioka et al., 2012).

O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade de Trichoderma spp. em promover o crescimento de plantas de feijão (Phaseolus vulgaris L.) e reduzir a severidade da antracnose do feijoeiro, bem como avaliar e identificar as espécies dos isolados mais eficientes.

Material e Métodos

Os experimentos foram realizados no laboratório e casa de vegetação do Laboratório de Bioquímica Fitopatológica do Instituto Biológico, em Campinas, SP, no período de março de 2010 a janeiro de 2012.

Foram utilizados 60 isolados de Trichoderma spp. pertencentes à Coleção de Culturas do Laboratório de Bioquímica Fitopatológica do Instituto Biológico. Os inóculos dos isolados foram produzidos, separadamente, em sacos de plástico de polipropileno transparentes, contendo grãos de arroz umedecidos e autoclavados, mantidos em câmara tipo BOD por sete dias a: 25±2ºC, fotoperíodo de 12 horas de luz e escuro (Papavizas, 1982; Silva, 1997). Para obtenção do inóculo de C. lindemuthianum, raça 65 (14313-65 NPAF- Embrapa), o fungo foi cultivado em placas contendo meio Mathur (Rey et al., 2005). A suspensão aquosa foi preparada pela remoção dos conídios da superfície do meio de cultura com água destilada esterilizada. A concentração foi ajustada com auxílio de microscópio óptico e câmara de Neubauer para 1x10⁶ conídios mL^-1.

No ensaio de promoção de crescimento, realizado em casa de vegetação, os 60 isolados de Trichoderma spp. foram adicionados, separadamente, ao substrato Tropstrato HT (Vida Verde, Mogi Mirim, SP), utilizado no cultivo de feijão 'Pérola'. A infestação foi feita pela adição de 20 g de arroz colonizado pelos isolados de Trichoderma spp. (em média 3,7x10⁹ conídios por grama de arroz), em cada litro de substrato. Sacos transparentes contendo a mistura de substrato e inóculo foram incubados por sete dias em temperatura ambiente. Após este período, a mistura foi homogeneizada e distribuída em sacos pretos de polietileno (300 g por saco). O plantio foi feito com cinco sementes de feijão 'Pérola' por saco. Foram utilizadas cinco repetições, o que totalizou 25 plantas por tratamento. No tratamento controle, realizou-se a adição de arroz sem o crescimento de microrganismos. O ensaio foi repetido três vezes em 2010: uma vez em março e duas em abril. A avaliação do ensaio foi feita 15 dias após o plantio, quando a parte aérea das plantas foi removida e submetida à secagem em estufa por 72 horas, a 70ºC, até obtenção da massa de matéria seca constante. Utilizou-se o delineamento inteiramente casualizado, com cinco repetições de cinco plantas cada uma. A massa do sistema radicular não foi avaliada, tendo-se optado pela medição da parte aérea apenas, que reflete o bom desenvolvimento do sistema radicular (Björkman et al., 1998).

Para avaliar o efeito dos isolados de Trichoderma spp. na severidade da doença, grãos de arroz colonizados com os sete isolados de Trichoderma spp. que mais se destacaram no teste de promoção de crescimento, com aumentos superiores a 30% na produção de matéria seca das plantas de feijão, foram adicionados, separadamente, na proporção de 2% (peso:volume), próximos à base de plantas de feijão com 15 dias de idade. A concentração de Trichoderma spp. utilizada no ensaio foi determinada pela quantificação do número de conídios, por meio de diluição seriada de amostras de 1 g de arroz colonizado em 9 mL de solução salina a 0,9%, e contagem dos conídios em microscópio ótico. As concentrações de conídios variaram de 1,4 a 5,6x10⁹ conídios por grama de arroz colonizado. Como controle, empregou-se arroz comercial sem Trichoderma spp inserido no substrato.

Sete dias após a inoculação com Trichoderma spp., a parte aérea das plantas foi inoculada por aspersão de suspensão aquosa de conídios de C. lindemuthianum (1x10⁶ conídios mL^-1). As plantas foram mantidas por 48 horas em câmara úmida com fotoperíodo de 12 horas e, em seguida, deixadas em temperatura ambiente. Foram utilizadas dez plantas por tratamento. Sete dias após a inoculação com o patógeno, foi avaliada a severidade da doença, em duas folhas por planta, pela quantificação da área foliar lesionada por meio do programa Quanti V. 1.0, para quantificação de doenças de plantas, da Universidade Federal de Viçosa (Vale et al., 2001). A severidade da doença foi expressa em percentagem de área lesionada. A proteção foi calculada como redução da severidade da doença e expressa como percentagem do controle, de acordo com Moraes et al. (1976).

O isolado IB 28/07 foi selecionado aleatoriamente entre os isolados com melhores resultados nos ensaios de promoção de crescimento e redução de severidade da doença para avaliação do efeito de diferentes concentrações do inóculo. As concentrações de 0,5, 1, 1,5 e 2% (peso:volume) desse isolado foram adicionadas próximo à base das plantas de feijão com 15 dias de idade, sete dias antes da inoculação do patógeno (1x10⁶ conídios mL^-1). A avaliação da severidade da doença foi realizada da mesma forma descrita anteriormente.

Os sete isolados de Trichoderma spp. que mais se destacaram nos ensaios de promoção de crescimento e na redução da severidade da doença foram submetidos ao sequenciamento gênico para a identificação das espécies. A extração de DNA foi realizada conforme Murray & Thompson (1980). Para a reação em cadeia da polimerase (PCR), foram utilizados os pares de iniciadores ITS 1 (5' TCCGTWGGTGAACCWGC 3') e ITS 4 (5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3'), que amplificam a região espaçadora entre os genes ribossomais 18S e 26S (White et al., 1990). A reação foi conduzida em termociclador PTC-100 (MJ Research Inc., Watertown, MA, EUA), e as temperaturas e os tempos de incubação foram de: 94ºC por 2 min; 40 ciclos de 94ºC por 15 s, 56ºC por 30 s, 72ºC por 30 s; 72ºC por 4 min e 4ºC até a utilização das amostras. Os fragmentos de DNA amplificados foram purificados e submetidos à reação de sequenciamento com o reagente Big Dye Terminator 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), pelo método de terminação de cadeia (Sanger et al., 1977), e analisados em sequenciador automático ABI 377 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). As sequências de nucleotídeos foram submetidas aos programas TrichoBlast e TrichOkey, disponíveis em International Subcommission on Trichoderma and Hypocrea Taxonomy (2011), que permitem realizar a identificação molecular de fungos do gênero Trichoderma, por meio da comparação com sequências de espécies "vouchers" (Druzhinina et al., 2005; Kopchinskiy et al., 2005; Nagy et al., 2007).

Todos os experimentos foram repetidos três vezes. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e comparados pelo teste de Duncan e Tukey, a 1% de probabilidade, com uso do programa Assistat, versão 7.5 Beta (Silva & Azevedo, 2002).

Resultados e Discussão

No primeiro ensaio de promoção de crescimento, 54 isolados de Trichoderma spp., dos 60 avaliados, causaram aumentos significativos na produção de matéria seca das plantas de feijão, quando comparados ao tratamento controle (Tabela 1). A magnitude dos incrementos esteve entre 3,12 (IB 47/02) e 57,81% (IB 30/07). No segundo ensaio, 42 isolados aumentaram significativamente a massa de matéria seca das plantas de feijão, com variações entre 4,65% (IB 01/03 e IB 34/08) e 34,88% (IB 51/09). No terceiro ensaio, 53 isolados causaram aumentos significativos entre 3,70% (IB 01/01) e 57,41% (IB 43/14).

Carvalho et al. (2011) testaram o efeito de seis isolados de Trichoderma spp. no crescimento de plantas de feijão e observaram que quatro deles proporcionaram aumentos na massa de matéria seca da parte aérea das plantas entre 4,42 e 5,71%, percentagens semelhantes aos menores aumentos verificados no presente trabalho. Segundo Brotman et al. (2010), espécies de Trichoderma podem promover aumentos de até 300% no crescimento de plantas. O efeito benéfico desses fungos tem sido relatado no desenvolvimento de várias culturas de importância, como mamoeiro, tomateiro, soja, milho, pepineiro, pimentão e eucalipto (Carvalho Filho et al., 2008; Tavares, 2009; Fontenelle et al., 2011; Silva et al., 2011). Os aumentos na produção de matéria seca podem variar de acordo com o isolado de Trichoderma utilizado e a cultura. Tavares (2009) constatou incremento da massa de matéria seca de mudas de mamoeiro de até 110,73%, enquanto Fontenelle et al. (2011) verificaram aumentos de até 1.244,83% em tomateiro. Aumentos expressivos, entre 57 e 136%, também foram observados em Eucalyptus urophilla (Carvalho Filho et al., 2008).

O efeito de Trichoderma spp. no crescimento de plantas tem sido relacionado a diversos fatores, tais como proteção de plantas contra patógenos primários e secundários da rizosfera, produção de hormônios de crescimento de plantas, aumento da absorção e da translocação de nutrientes minerais, e aumento da solubilidade e da disponibilidade de vários micronutrientes (Yedidia et al., 2001).

Os sete isolados com melhor performance nas avaliações de promoção do crescimento (IB 19/17, IB 28/07, IB 28/09, IB 30/06, IB 30/07, IB 43/14 e IB 51/09), que proporcionaram aumentos na massa de matéria seca da parte aérea superiores a 30%, conferiram proteção à antracnose quando adicionados uma semana antes da inoculação do patógeno, com percentagens de proteção que variaram entre 77,60 e 97,54% (Tabela 2). De acordo com Sriram et al. (2009), linhagens selecionadas de espécies de Trichoderma são potentes indutores de respostas de defesa em plantas. De Meyer et al. (1998) aplicaram T. harzianum T30 no solo, sete dias antes da inoculação de Botrytis cinerea em alface, tomate, pimentão, fumo e feijão, e observaram reduções significativas do mofo-cinzento em todas as culturas. Nas plantas de feijão, os autores relataram redução de 35% na severidade da doença, e, como não encontraram o isolado T30 nas folhas, eles atribuíram a redução dos sintomas da doença à indução de resistência ativada pelo antagonista. A proteção de plantas de feijão por T. harzianum foi relatada por Abeysinghe (2009), que utilizou o isolado RU01 adicionado ao solo sete dias antes da inoculação de Uromycesappendiculatus, agente causador da ferrugem do feijoeiro. As reduções observadas na severidade da doença variaram de 44 a 47%. Sriram et al. (2009) constataram reduções entre 48 e 62%, proporcionada por T. harzianum, na infecção causada por Phytophthora capsici, em pimenta vermelha, enquanto Bae et al. (2011) verificaram que o isolado DIS 376f de T. theobromicola foi capaz de atrasar o desenvolvimento de sintomas de doença causados por P. capsici em pimentão.

Nos últimos anos, vários trabalhos têm buscado elucidar os mecanismos de proteção de plantas contra fitopatógenos pela aplicação de Trichoderma spp. Segundo Brotman et al. (2010), isolados de Trichoderma spp. colonizam a epiderme e as células do córtex de raízes e, consequentemente, ativam vias de sinalização, o que desencadeia respostas de defesa nas plantas. Salas-Marina et al. (2011) observaram que a colonização de raízes de Arabidopsis por T. atroviride induziu a expressão dos genes de defesa PR1, PR2 (β-1,3-glucanase), PDF1.2 (defensina) e LOX-1 (lipoxigenase), envolvidos nas vias metabólicas do ácido salicílico, do ácido jasmônico e do etileno.

A incorporação de diferentes concentrações do isolado IB 28/07 (T. strigosum) ao substrato e a posterior inoculação das folhas de feijoeiro com C. lindemuthianum resultaram na redução da severidade da doença com o aumento na concentração do fungo (Tabela 3). Todas as concentrações aplicadas conferiram proteção das plantas à antracnose, que variou de 41,51 a 96,06%, sendo que as menores concentrações (0,5 e 1%) apresentaram redução da severidade da doença significativamente inferior à da maior concentração (2%). A ação de T. strigosum na proteção de plantas contra fitopatógenos também foi constatada por Fontenelle et al. (2011). Estes autores verificaram reduções de 83,79 e 93,99% respectivamente na severidade das doenças causadas por Xanthomonas euvesicatoria e Alternaria solani, em tomateiro. Isolados de Trichoderma spp. são capazes de produzir mais de 100 tipos de compostos bioativos, o que inclui enzimas degradadoras de parede celular, antibióticos e muitas outras substâncias ainda não caracterizadas, as quais podem apresentar propriedades antifúngicas ou atuar como elicitores de respostas de defesa das plantas (Yedidia et al., 2003; Woo & Lorito, 2007).

Dos sete isolados mais eficientes de Trichoderma spp., cinco (IB 19/17, IB 28/09, IB 30/06, IB 30/07 e IB 51/09) foram identificados como T. harzianum, um (IB 28/07) como T. strigosum e um (IB 43/14) como T. theobromicola. Os isolados apresentaram similaridade superior a 98%, em comparação aos isolados "voucher" das bases de dados, para a região ITS, identificados pelo programa TrichOkey. Os resultados obtidos confirmam dados da literatura quanto à capacidade das espécies T. harzianum, T. strigosum e T. theobromicola de promoverem o crescimento de plantas e reduzirem a severidade de doenças causadas por patógenos foliares (Sriram et al., 2009; Bae et al., 2011; Fontenelle et al., 2011; Silva et al., 2011).

Conclusões

1. Isolados de Trichoderma spp. podem promover o crescimento e reduzir a severidade da antracnose em plantas de feijão 'Pérola', em condições de casa de vegetação.

2. As espécies Trichoderma harzianum, T. strigosum e T. theobromicola são eficientes na promoção de crescimento de plantas e na proteção do feijoeiro contra a antracnose, causada por Colletotrichum lindemuthianum, em condições de casa de vegetação.

3. Trichodermastrigosum (IB 28/07) confere proteção sistêmica de plantas de feijoeiro 'Pérola' a C. lindemuthianum proporcional à concentração de inóculo utilizada, em condições de casa de vegetação.

Agradecimentos

Ao engenheiro agrônomo Luiz Fukuhara, da Empresa Binova, pelo auxílio financeiro.

Recebido em 14 de maio de 2012 e aprovado em 3 de outubro de 2012

Datas de Publicação

Histórico